Otra razón para comer tu brócoli

La diabetes tipo 2 se está haciendo más común a nivel mundial, y no todos los pacientes pueden ser tratados exitosamente con los fármacos existentes. Axelsson et al. analizaron el patrón de la expresión génica asociada con la diabetes tipo 2 y lo compararon con las firmas génicas de miles de fármacos candidatos para hallar compuestos que pudieran contrarrestar los efectos de la diabetes. El candidato principal de este análisis fue el sulforafano, un compuesto natural hallado en el brócoli y en otros vegetales. Los autores mostraron que el sulforafano inhibe la producción de glucosa en células cultivadas y mejora la tolerancia a la glucosa en roedores con dietas altas en grasa o altas en fructosa. Por otra parte, en un ensayo clínico, el extracto de germen de brócoli fue bastante bien tolerado y mejoró la glucosa en ayuno en pacientes humanos con obesidad y diabetes tipo 2 desregulada.

El efecto del SFN en la producción de glucosa es controlado por el factor de transcripción NRF2.

Posteriormente, investigamos el efecto del SFN en la translocación nuclear del NRF2, lo cual ha demostrado ser un mecanismo de acción sumamente importante para el SFN en otros tipos de células (31). Observamos un claro efecto dependiente de la dosis de SFN en la translocación nuclear del NRF2 en las células H4IIE (Fig. 1D). El silenciamiento del Nrf2 por ARN pequeño de interferencia (siARN) (descomposición de 81 ± 3%) incrementó la producción de glucosa de 2 a 3 veces (P = 0.0009) y atenuó el efecto relativo del SFN en la producción de glucosa (P = 0.007; Fig. 1E). Esto sugiere que una gran parte de la reducción de la producción de glucosa causada por el SFN es controlada mediante el NRF2, aunque no aseguramos que otros mecanismos pudieran estar involucrados también.

El SFN no tiene efectos en las señales de comunicación de la insulina y en el consumo de oxígeno mitocondrial.

Puesto que la insulina es un regulador clave de la producción de glucosa hepática en el estado postprandial, después examinamos el efecto del SFN en las enzimas clave de la cascada de señales de la insulina. No obstante, en las células H411E, la fosforilación regulada por la insulina del receptor de insulina substrato 1 (IRS1/Tyr608) y AKT serina/treonina quinasa 1 (AKT1/Ser473) no se vio afectada por el SFN. Por otro lado, no observamos efectos del SFN en las señales de comunicación de la insulina después del pre tratamiento con ácido palmítico (fig. S1B). Las observaciones son congruentes con los datos de la producción de glucosa (Fig. 1A), lo que sugiere que los efectos combinados del SFN y de la insulina en la producción de glucosa son no sinérgicos sino meramente aditivos. Estos resultados demuestran que el efecto del SFN en la producción de glucosa no es ejercido principalmente por medio de la alteración de las señales de comunicación de la insulina.

Debido a que el NRF2 afecta la actividad del complejo 1 en la cadena respiratoria mitocondrial por medio de la limitación de sustratos (32), también investigamos si el SFN afectaba la función mitocondrial, utilizando el instrumento Seahorse XF24 para medir la tasa de consumo de oxígeno mitocondrial (OCR) en células H4IIE, en respuesta a sustratos gluconeogenéticos (L-lactato, ácido pirúvico, y L-glutamina). Sin embargo, el SFN (3 μM) no afectó la OCR mitocondrial bajo estas condiciones experimentales (fig. S1C).

El SFN reduce la expresión de genes involucrados en la producción de glucosa.

Para explorar más a fondo el mecanismo por el cual el SFN afecta la producción de glucosa, analizamos la expresión de genes involucrados en la gluconeogenésis, un factor determinante en la producción de glucosa hepática. De las cuatro enzimas clave involucradas en la gluconeogenésis – piruvato carboxylasa (PC; P = 0.2), fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 1 (PCK1; también conocida como PEPCK-C; P = 0.004), fructosa-1,6-bisfosfatasa 1 (FBP1; P = 0.0007), y glucosa-6-fosfatasa, subunidad catalítica (G6PC; P = 0.002)– todos excepto el PC fueron considerablemente disminuidos y regulados por el SFN, como se evaluó mediante la expresión de micro configuraciones de células H4IIE (Tabla 4). La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa de las células H4IIE tratadas con 3 μM de SFN durante 24 horas confirmó estos hallazgos, siendo Pck1 y G6pc los genes de gluconeogénesis más fuertemente regulados por el SFN (Fig. 1F).

El PCK1 es de especial interés puesto que cataliza la conversión del ácido oxaloacético en ácido fosfoenolpirúvico, el paso limitante de velocidad en la gluconeogénesis. El SFN redujo la proteína PCK1 en un 60% en las células H4IIE (P = 0.0011; Fig. 1G). También analizamos los efectos del SFN en la proteína PCK1 después de la descomposición del Nrf2 y observamos una simple reducción del 22% de la PCK1, la cual es una atenuación considerable en comparación con la reducción del 60% en las células de control (P = 0.0082 para la comparación de los efectos del SFN en el Nrf2-KD contra células de control; Fig. 1G). Esto sugiere que la regulación de la PCK1 por el SFN es ampliamente controlada mediante el NRF2.

Posteriormente silenciamos la Pck1 con siRNA (Pck1-KD) en células H4IIE (69 ± 2% de descomposición), lo cual dio como resultado una reducción del 38% en la producción de glucosa. El efecto inhibitorio del SFN en la producción de glucosa fue atenuado en un 23% (49% de reducción de la producción de glucosa por el SFN en células de control, en comparación con una reducción del 38% en células Pck1-KD; P = 0.025; Fig. 1H). En contraste, el efecto de la metformina (250 μM) no se vio afectado por la Pck1-KD (38% de reducción en ambos casos), lo que muestra que la supresión de la producción de glucosa, inducida por la metformina, es independiente de la PCK1. También observamos que el efecto de la insulina fue reducido considerablemente (33% de reducción del tamaño del efecto; P = 0.037) en células Pck1-KD, confirmando observaciones previas de que la PCK1 es regulada por la insulina (33). En conjunto, estos datos sugieren que un mecanismo muy importante para la reducción de producción de glucosa controlada por el SFN es la regulación de las enzimas gluconeogenéticas clave mediante la NRF2. Por lo tanto, el mecanismo de acción del SFN es diferente al de la metformina, el cual actúa mediante una proteína quinasa activada por AMP, mediante la disminución de AMP cíclico y la inhibición del glicerofosfato deshidrogenasa mitocondrial (12-14).

Como con la metformina, la cual tiene múltiples modos de acción, no excluimos qué mecanismos adicionales podrían contribuir con los efectos del SFN en la producción de glucosa.

El SFN reduce la producción de glucosa en hepatocitos de ratones.

También comprobamos que el SFN afecta la producción de glucosa en hepatocitos primarios de ratones. Los hepatocitos fueron incubados con SFN en presencia de ácido palmítico durante 24 horas antes de los experimentos, para reproducir un medio diabetogénico. La incubación en ácido palmítico incrementó la producción de glucosa 2.2 veces. El SFN indujo una reducción del 45% de la producción de glucosa en hepatocitos expuestos a ácido palmítico (P = 0.042; Fig. 2A) y restableció la producción de glucosa a niveles observados en ausencia de ácido palmítico. Estos datos corroboran las observaciones en células H4IIE y muestran que el tratamiento con SFN elimina la sobre producción de glucosa, desatada por un medio diabetogénico in vitro.

Fig. 2 Efectos del SFN en hepatocitos de ratones y en modelos de ratas con intolerancia a la glucosa, inducida por la dieta.

(A) Producción de glucosa a partir de hepatocitos primarios de ratones durante 45 minutos. Las células fueron pre incubadas en presencia o ausencia de 500 μM de albúmina de suero bovino unida a ácido palmítico, seguida de una incubación de 24 horas con o sin 3 μM de SFN como se indica (n = 3).

(B) Izquierda: glucosa sanguínea en ayuno en ratas Wistar macho antes y después de 15 semanas con una dieta alta en grasas con o sin un tratamiento de SFN concomitante [SFN (2.5 mg/kg) tres veces por semana; n 0 9 por grupo]. Derecha: medidas longitudinales de glucosa en ayuno durante el periodo de 15 semanas. Se muestra el valor de P para la glucosa sanguínea para los especímenes tratados con SFN, en comparación con ratas de control durante el periodo de 3 a 15 semanas.

(C) IPITT (prueba intraperitoneal de tolerancia a la insulina) después del periodo de 15 semanas para las mismas ratas que en (B).

(D a G) Resistencia a la insulina (IR) e intolerancia a la glucosa en los mismos animales que en (B) después de 5 semanas adicionales a 60% de dieta alta en fructosa (HFrD) o alta en grasas (HFD) con o sin tratamiento de SFN concomitante. Datos de la IPGTT (prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa) (D) e IPITT (E) de ratas a 60% de HFrD (n = 4 a 5 por grupo), y datos de IPGTT (F) e IPITT (G) de ratas a 60% de HFD (n = 4 a 5 por grupo).

(H) Datos de OGTT de ratas Wistar macho a las que se dio una dieta de control baja en grasas (ctrl diet) o una dieta HFD al 60% durante 11 meses, antes y después de 14 días de tratamiento con SFN (5 mg/kg por día) o excipiente (n = 5 HFD ctrl, n = 6 HFD SFN, y n = 8 ctrl diet).

(I) OGTT en ratas Wistar macho con intolerancia a la glucosa inducida por la dieta (a las que se dio una HFrD al 60% durante 6 meses) después de 10 días de tratamiento con o sin SFN (10 mg/kg por día, ip) o metformina (300 mg/kg, po) como se indica. * denota SFN (n = 6) versus excipiente (n = 7); # denota metformina (n = 6) versus el excipiente correspondiente (n = 8).

(J) IPPTT en las mismas ratas que en (I) después de 9 a 12 días de tratamiento con o sin SFN o metformina como se indica. Se utilizó una prueba t unilateral para el análisis estadístico. * denota SFN (n = 6) versus excipiente (n = 7); # denota metformina (n = 6) versus el excipiente correspondiente (n = 7). Los datos son medias ± EEM. *P < 0.05; **P < 0.01; #P < 0.05; ##P < 0.01.

El SFN previene el desarrollo de la intolerancia a la glucosa en ratas con dietas controladas.

Después de estos experimentos, nos propusimos investigar el efecto del SFN en diferentes modelos animales in vivo. Primero, evaluamos la capacidad del SFN de prevenir el desarrollo de intolerancia a la glucosa. Se dio a ratas Wistar macho una dieta con 45% de contenido de grasa [dieta alta en grasa (HFD)] y fueron tratadas concomitantemente con SFN [2.5 mg/kg, intraperitoneal (ip), tres veces por semana] o excipiente a lo largo de 15 semanas. En animales tratados con un excipiente, la glucosa sanguínea en ayuno, la cual refleja la producción de glucosa hepática, se incrementó en un 16% durante el periodo de 15 semanas con una dieta HFD (P = 0.0014). En contraste, no hubo una disminución de la glucosa en ayuno en ratas tratadas con SFN (Fig. 2B). A lo largo del periodo completo, la glucosa sanguínea en ayuno fue considerablemente menor en especímenes tratados con SFN, en comparación con ratas no tratadas (en promedio 7.5% menor; P = 2 × 10−5; Fig. 2B). Al final del periodo de 15 semanas, también hubo una diferencia considerable en la sensibilidad a la insulina entre el grupo tratado con SFN y el grupo no tratado, como se midió mediante una prueba intraperitoneal de tolerancia a la insulina (IPITT) [P = 0.032 para el área bajo la curva (AUC); Fig. 2C].

Para explorar más a fondo la capacidad del SFN para prevenir la intolerancia a la glucosa bajo diferentes condiciones alimenticias, cambiamos las dietas después de 15 semanas con un régimen HDF al 45%. A la mitad de las ratas se les dio, en su lugar, una dieta con mayor contenido de grasas (60%), y a la otra mitad se les dio una dieta con 60% de contenido de fructosa [dieta alta en fructosa (HFrD)] manteniendo el tratamiento con SFN o un excipiente. El SFN mejoró la tolerancia a la glucosa, evaluada mediante una prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa (IPGTT) después de 5 semanas con un régimen HFrD al 60% (AUC30–120 P = 0.025, Fig. 2D; Fig. 2E para el IPITT). En ratas con un régimen HFD al 60%, el SFN no afectó la tolerancia a la glucosa (Fig. 2F) pero cambió la sensibilidad a la insulina, como fue evaluado mediante una IPITT (AUC P = 0.0038; Fig. 2G). Estos hallazgos demuestran que el SFN fue capaz de prevenir el desarrollo de la intolerancia a la glucosa, inducido por la dieta, inducida por un régimen HFD al 45%, o HFrD al 60%, aunque el HFD al 60% era demasiado severo como para que el SFN previniera completamente la intolerancia a la glucosa.

También extrajimos tejido hepático de ratas con un régimen HFrD al 60% tratadas con SFN (2.5 mg/kg), tres veces a la semana durante 27 semanas, y analizamos la expresión génica global mediante una micro configuración. Analizamos el efecto del SFN en la firma patológica hepática de 50 genes y observamos que una fracción considerable de la firma era revertida en ratas tratadas con SFN, en comparación con animales tratados con un excipiente (P < 0.0001, prueba exacta de Fisher; fig. S2).

El SFN mejora la tolerancia a la glucosa en ratas con un régimen HFD o HFrD.

Con base en la observación de que el SFN previene la intolerancia a la glucosa, inducida por la dieta, quisimos posteriormente probar si el SFN podría ser usado para tratar ratas que ya hubieran desarrollado intolerancia a la glucosa. De esta manera, se dio a las ratas macho Wistar una dieta HFD al 60% durante 11 meses y luego recibieron SFN (5 mg/kg, ip) diariamente durante 14 días. El tratamiento con SFN dio como resultado una mejora en la tolerancia la glucosa, como lo confirmó una prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT) (P = 0.049 para AUC30–120; Fig. 2H).

Posteriormente, comparamos los efectos del SFN y la metformina en la tolerancia a la glucosa y la producción de glucosa hepática in vivo. Las ratas macho Wistar a las cuales se había dado una dieta HFrD al 60% durante 6 meses fueron tratadas con SFN (10 mg/kg, ip), o bien metformina [300 mg/kg, por os (po)] durante 9 a 12 días. La tolerancia a la glucosa mejoró de manera considerable tanto con SFN como con metformina durante una OGTT (AUC30–120 P = 0.046 para ratas tratadas con SFN versus ratas no tratadas y P = 0.019 para ratas tratadas con metformina versus ratas no tratadas; Fig. 2I). Con base en nuestras observaciones en células H4IIE y hepatocitos primarios, postulamos la hipótesis de que el SFN reduciría la producción de glucosa hepática. La producción de glucosa hepática fue analizada mediante una prueba de tolerancia intraperitoneal al ácido pirúvico (IPPTT), la cual mostró que el SFN redujo considerablemente la glucosa sanguínea a los 30 y 120 minutos, y redujo el AUC30–120 en un 20% (P = 0.049, prueba t unilateral; Fig. 2J). La metformina redujo de manera considerable la glucosa sanguínea a los 60 minutos durante la IPPTT y redujo el AUC30–120 en un 25% (P = 0.046, prueba t unilateral). Estos resultados demuestran que el SFN mejora la tolerancia la glucosa en ratas, en una magnitud similar a la de la metformina.

El SFN mejora la tolerancia a la glucosa en ratones con diabetes inducida por la dieta.

Para analizar el efecto del SFN en un modelo de diabetes más severo, utilizamos ratones C57BL/6J, los cuales desarrollan diabetes manifiesta cuando se les compromete con una dieta HFD. Después de 10 semanas con una dieta HFD al 60%, los ratones machos C57BL/6J fueron tratados con SFN (10 mg/kg) diariamente durante 4 semanas (misma dosis utilizada en los experimentos de ratas). También analizamos el efecto de una dosis considerablemente más baja (0.5 mg/kg de SFN diariamente). La alta dosis de SFN mejoró tanto la glucosa en ayuno (P = 0.044), como la tolerancia a la glucosa (AUC30–120 P = 0.012; Fig. 3A), como lo determinó una IPGTT. En este modelo, el SFN no afectó la sensibilidad a la insulina (Fig. 3B). La baja dosis de SFN no tuvo efectos en la tolerancia a la glucosa. Una muestra de hígado extraído de ratones tratados con SFN en altas dosis tenía un contenido de triglicéridos reducido, en relación con los ratones que recibieron la dosis baja (P = 0.038; Fig. 3C). En ratones magros que recibieron una dieta de control baja en grasas, la tolerancia a la glucosa no se vio afectada por el SFN (Fig. 3A).

Fig.3

Efectos del SFN en ratones con diabetes inducida por la dieta.

(A) IPGTT en ratones C57BL/6J machos a los que se dio una dieta de control baja en grasas o una dieta HFD al 60% durante 14 semanas, tratados con un excipiente o SFN (0.5 or 10 mg/kg por día) durante 4 semanas (n = 7 a 8 en cada uno de los grupos de HFD, n = 5 a 6 en cada uno de los grupos de dieta de control).

(B) Datos de la IPITT de los ratones en (A).

(C) Contenido de triglicéridos en tejido hepático extraído de los ratones tratados como en (A).

(D) Tasa de gluconeogénesis en ratones machos C57BL/6J a los que se dio una dieta HFD al 60% durante 12 semanas y se trató con un excipiente o SFN (10 mg/kg por día) durante 4 semanas (n = 8 por grupo). Las barras muestran datos de los grupos enteros (peso promedio 40 ± 2 g para los tratados con excipiente y 39 ± 1 g para los tratados con SFN), así como datos de los tres ratones en cada grupo con el mayor peso corporal (pesado; peso de 42, 42, y 47 g para los tratados con excipiente y 39, 40 y 48 g para los tratados con SFN, en comparación con un peso promedio de 38 ± 1 g para los ratones ligeros tratados con excipiente y 37 ± 0.2 g para los tratados con SFN).

(E) Tasa de desaparición de glucosa (Rd) durante clamp, lo que refleja el consumo de glucosa estimulado por la insulina en todo el cuerpo, para los mismos ratones que en (D). Los datos son medias ± EEM *P < 0.05; **P < 0.01.

Posteriormente, realizamos mediciones específicas de la tasa gluconeogenética absoluta en ratones C57BL/6J con una dieta HFD al 60%, utilizando espectrometría de masa de fragmentos de glucosa después de la ingestión de agua pesada, en combinación con clamps euglicémicos-hiperinsulinímicos. Los ratones fueron tratados con SFN (10 mg/kg) o un excipiente de control diariamente durante 4 semanas. Después de un ayuno de 7 a 9 horas y una infusión de 2 horas de glucosa [6,6-2H2], la producción de glucosa se derivaba casi enteramente de la gluconeogénesis (101 ± 2% para los ratones de control y 97 ± 3% para los tratados con SFN). En los sujetos de control, observamos una clara correlación entre el peso corporal de los ratones (intervalo, 36 a 47 g) y la tasa gluconeogenética (R2 = 0.81; P = 0.002). Esto va de la mano con informes en humanos que muestran que la producción de glucosa es demasiado alta en personas obesas, en comparación con sujetos delgados (34-36). En ratones tratados con SFN, la correlación entre el peso y una mayor gluconeogénesis fue desechada completamente (R2 = 0.11; P = 0.5), sugiriendo que el SFN protege contra una mayor gluconeogénesis en animales con sobrepeso. Sin embargo, al utilizar un análisis post hoc de los ratones más pesados, observamos que el SFN redujo considerablemente la tasa de gluconeogénesis absoluta, en comparación con los sujetos de control en este subgrupo (6.5 mg/kg por minuto en individuos de control y 5.6 mg/kg por minuto en ratones tratados con SFN; P = 0.035; Fig. 3D).

Durante el clamp, también medimos el consumo corporal total de glucosa estimulada por la insulina (clamp Rd), el cual refleja la sensibilidad a la insulina. Este resultó similar entre los grupos [ctrl (11.8 mg/kg) y SFN (12.8 mg/kg); Fig. 3E], lo cual va en línea con nuestros hallazgos en las células H4IIE de que el SFN no influye en las señales de comunicación de la insulina. En conjunto, estos experimentos demuestran que el SFN mejora la tolerancia a la glucosa en animales con diabetes inducida por la dieta, mediante una tasa gluconeogenética reducida.

Fecha: 14 de junio de 2017

Link: http://stm.sciencemag.org/content/9/394/eaah4477

Science Translational Medicine  

Vol. 9, Edición 394, eaah4477

DOI: 10.1126/scitranslmed.aah4477

Autores: Annika S. Axelsson1, Emily Tubbs1, Brig Mecham2, Shaji Chacko3, Hannah A. Nenonen1, Yunzhao Tang1, Jed W. Fahey4, Jonathan M. J. Derry5, Claes B. Wollheim1,6, Nils Wierup1, Morey W. Haymond3, Stephen H. Friend5, Hindrik Mulder1 and Anders H. Rosengren1,5,7,*

MATERIALES SUPLEMENTARIOS

www.sciencetranslationalmedicine.org/cgi/content/full/9/394/eaah4477/DC1

Nota: Instituto Nutrigenómica no se hace responsable de las opiniones expresadas en el presente artículo.