Puntos destacados

• Una prueba cruzada no muestra un efecto clínico diferencial del pan blanco contra el pan integral de masa fermentada
• La composición del microbioma, en general, mostró resiliencia a la intervención alimenticia con pan
• La respuesta glucémica de los dos tipos de pan varía bastante de persona a persona
• El clasificador con base en el microbioma predice de forma precisa el tipo de pan que induce determinada respuesta glucémica

Conclusiones

En este estudio, no hay diferencias considerables en un amplio conjunto de parámetros clínicos entre dos intervenciones alimenticias de una semana de duración, una incluyendo el consumo de pan blanco industrial hecho de trigo refinado, y la otra consumo de pan leudado con masa fermentada hecho de granos enteros utilizando métodos tradicionales. Esto ocurrió a pesar de cambios estadísticamente relevantes, si bien es cierto que pequeños, en los niveles de los mismos parámetros después de la primera semana de consumo de pan, independientemente del tipo. Un análisis del microclima intestinal reveló efectos diferenciales de tratamiento entre los dos tipos de pan sólo en dos taxones, y mostró que la composición de la microbiota permanecía generalmente estable y específica para cada persona a lo largo de esta prueba. Finalmente, utilizando un riguroso marco estadístico, demostramos una variación interpersonal marcada y altamente relevante en la respuesta glucémica a los dos tipos de pan, mostrándose en algunos sujetos, una respuesta más alta a un tipo de un pan, y otros, a la otra. Adicionalmente, demostramos que el tipo de pan que induce las mayores respuestas glucémicas podría ser predicho para cada sujeto utilizando sólo datos del microbioma.

Comprender la variación interpersonal en el efecto del pan, uno de los alimentos más comúnmente consumidos, permitiría la personalización de recomendaciones nutricionales relacionadas con el pan y la optimización de opciones alimenticias a nivel mundial.

En términos más generales, nuestro estudio subraya la importancia de la personalización en las recomendaciones alimenticias, puesto que incluso la comparación directa de panes comúnmente considerados “saludables” y “poco saludables” reveló efectos personales en la PPGR, lo que sugiere que las recomendaciones alimenticias universales podrían tener un eficacia limitada.

Métodos STAR

Tabla de Recursos Clave

Modelo experimental y detalles de los sujetos

Cohorte principal del estudio

Veinte adultos saludables fueron incluidos en este estudio, incluyendo nueve hombres (cuatro en SW, cinco en WS) y 11 mujeres (seis en SW, cinco en WS), de 27 a 66 años de edad (38.2 ± 11.3 [media ± DE], Tabla 1 para las características del grupo). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Revisión (IRB) del Tel Aviv Sourasky Medical Center, con números de aprobación TLV-0658-12, TLV-0050-13 and TLV-0522-10. Los sujetos firmaron formularios de consentimiento informado.

Cohorte de referencia

Analizadas aquí, están muestras de una prueba previa (Zeevi et al., 2015). Las características de base de todos los sujetos analizados están presentadas en la tabla S4.

Detalles del Método

Prueba Clínica

Este estudio fue una prueba cruzada aleatorizada en un solo centro, llevada cabo en el Weizmann Institute of Science, en Israel. No se realizaron cambios al protocolo y a los métodos del estudio después de que comenzó la prueba.

Treinta y cuatro sujetos fueron reclutados para este estudio durante el mes de febrero de 2016. Doce sujetos potenciales se retiraron debido a razones personales o requisitos del estudio, y dos fueron excluidos debido a los criterios de exclusión, todo esto antes de la aleatorización. Las distribuciones de grupos aleatorizados fueron generadas por computadora sin restricciones. El reclutamiento y seguimiento fueron llevados a cabo por profesionales certificados en investigación clínica. Veinte sujetos saludables fueron eventualmente aleatorizados sin restricciones, y la prueba tuvo lugar entre el 21 de febrero y el 5 de abril de 2016 (Figura S1).

La prueba se completó como se había planeado. Los 20 sujetos completaron la prueba y no hubo expulsiones o deserciones. Ninguno de los sujetos del estudio informó sobre efectos adversos. El cumplimiento de las intervenciones fue evaluado utilizando registros en tiempo real de todas las comidas consumidas, realizadas en una aplicación para teléfonos móviles que nosotros desarrollamos (Zeevi et al., 2015)

Criterios de exclusión inclusión

Todos los sujetos cumplieron con los siguientes criterios de inclusión: hombres y mujeres de 18 a 70 años de edad que actualmente no lleven ningún régimen nutricional o esquema de seguimiento con un nutricionista y que sean capaces de proporcionar consentimiento informado y manipular técnicamente un glucómetro para la prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT) y la calibración de los monitores continuos de glucosa (CGM). Los criterios de exclusión incluían: (i) tratamientos de embarazo o fertilidad; (ii) utilización de antibióticos o anti fúngicos durante los tres meses previos a la participación; (iii) enfermedad crónica inflamatoria activa o neoplásica durante los tres años previos a la participación; (iv) trastorno gastrointestinal crónico, incluyendo enfermedad inflamatoria intestinal y enfermedad celíaca; (v) enfermedad de la piel, incluyendo dermatitis de contacto, que descarte una colocación adecuada del CGM; (vi) trastorno neuro psiquiátrico activo; (vii) infarto al miocardio o accidente cerebrovascular durante los seis meses previos a la participación; (viii) trastornos de coagulación; (ix) utilización de medicación inmunosupresora crónica; (x) diabetes mellitus tipo I o tipo II pre diagnosticada, o tratamiento con medicación para la diabetes. El cumplimiento de los criterios de inclusión y exclusión fue validado por médicos.

Variables resultantes

Medimos las variables resultantes en el punto de partida, después del primer periodo de intervención, después del periodo de recuperación, y al final del segundo periodo de intervención (Figura 1A). Las variables resultantes predeterminadas consistían en: (a) pruebas de sangre, realizadas después del ayuno los días 0, 7, 21 y 28, midiendo los niveles de triglicéridos, colesterol LDL, colesterol HDL, colesterol total, alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), hierro, calcio, creatinina, urea, hormona estimulante de la tiroides (TSH), LDH y proteína C reactiva; (b) medidas de la presión arterial, tomadas con un monitor automatizado de presión arterial (modelo M6, Omron, Hoofddorp, Países Bajos) en los días 0, 7, 21 y 28; (c) medidas del peso y metabolismo basal (BMR), tomadas con el analizador de composición corporal segmental BC-418 (Tanita, Tokio, Japón) en los días 0, 7, 21 y 28; (d) niveles promedio de glucosa en la sangre dentro de los primeros 15 minutos después de despertar (denominada “glucosa al despertar”), tomada como el promedio de cuatro medidas automáticas continuas de glucosa (CGM; iPro2 por Medtronic, MN, EEUU) en los días 1 & 2, 5 & 6, 22 & 23, y 26 & 27; (e) respuesta de la glucosa sanguínea a la OGTT cuantificada como el área incremental bajo la curva de glucosa (iAUC con respecto a la glucosa media dentro de los primeros 30 minutos posteriores a la comida; Zeevi et al., 2015), después del consumo de 75 g de glucosa, medidos con un monitor de glucosa en la sangre (Contorno por Bayer AG, Leverkusen, Alemania), calculado como el promedio de dos pruebas realizadas en los días −6 & −5, 8 & 9, 15 & 16, and 29 & 30; (f) y análisis del microbioma, realizados en muestras fecales tomadas dentro de un plazo de 24 horas de los días −1, 6, 20 y 27. Todas las medidas se presentan en la Tabla S5.

Preparación del pan

La harina se molía a partir de trigo rojo duro (Triticum aestivum var. aestivum). La harina resultante se cernía a fin de remover sólo las partículas más grandes de salvado, lo que da como resultado una “tasa de extracción” del 98% (1000 g de trigo generaban 980 g de harina). Las hogazas eran preparadas utilizando los siguientes cuatro ingredientes: harina molida recién hecha como se describe anteriormente, agua, sal y masa madre madura sin ningún otro auditivo. La fórmula general para el pan era (en porcentaje de panaderos) 100% de harina, 90% de agua, y 1.8% de sal, en tanto que la porción de la masa madre representaba 37% del peso total de la harina (es decir, el 20% de la harina en la fórmula había sido pre fermentada). La mezcla era amasada en un recipiente circular, fermentada “en grueso” durante 1 hora a 24 °C y “retardada” a 4 °C durante 8 horas. La masa era colocada en porciones de 150 g, moldeada y transferida a moldes de hogazas, en donde era “leudada” (crecimiento final) durante 2 horas a 24 °C. Las hogazas eran horneadas en un horno de piedra a 245 °C durante aproximadamente 60 minutos para obtener un peso final de 1 kg después del horneado.

La composición del pan integral fue determinada por el laboratorio de alimentos y agua de Bactochem (Ness-Ziona, Israel), una compañía certificada por el Ministerio de Salud Israelí, excepto por el contenido de fibra, que fue estimado a partir de los valores de la Base de datos Nacional de Nutrientes de la USDA “Informe Básico 20080, harina de trigo, de grano entero” después de sustraer el 2% del salvado retenido. Para el pan industrial, utilizamos la etiqueta del fabricante. La composición de ambos tipos de pan se muestra en la Tabla S1.

Comidas estandarizadas

Le dimos a nuestros sujetos comidas estandarizadas al inicio de cada semana de intervención, de acuerdo con el tipo de intervención. Las comidas estandarizadas eran calculadas para tener 50 g de carbohidratos disponibles. Durante el periodo de intervención del pan blanco, los sujetos consumieron tres comidas de 110 g de pan blanco, y tres comidas de 110 g de pan blanco + 30 g de mantequilla. Durante la intervención del pan integral, los sujetos consumieron tres comidas de 145 g de pan integral, y tres comidas de 145 g de pan integral + 30 g de mantequilla. A los sujetos se dio la instrucción de consumir estas comidas inmediatamente después de su ayuno nocturno, para no modificar la comida, y para abstenerse de comer o realizar actividad física extenuante antes, y durante dos horas después del consumo.

Uso de fármacos

En el grupo WS, dos sujetos esporádicamente notificaron haber consumido NSAIDs. Un sujeto notificó un consumo regular de multivitaminas y omega 3. En el grupo SW, un sujeto notificó un consumo regular de vitamina D3, Eltroxin y Rampiril, y consumo esporádico de antiácidos; un sujeto notificó consumo regular de Losartan; un sujeto notificó consumo regular de suplementos de hierro, un sujeto notificó consumo de píldoras anticonceptivas multi vitaminas, y un consumo esporádico de NSAIDs; y un sujeto notificó consumo regular de píldoras anticonceptivas y un consumo esporádico de NSAIDs.

Muestreo y secuenciación del microbioma intestinal

Los sujetos tomaron ellos mismos muestras de sus heces usando un bastoncillo de algodón y siguiendo instrucciones impresas detalladas. Las muestras recolectadas eran inmediatamente almacenadas en una nevera doméstica (-20 °C) y transferidas a un refrigerador, proporcionado por nosotros, en nuestras instalaciones, donde eran almacenadas a -80 °C. Unificamos el ADN utilizando el equipo de aislamiento PowerMag Soil DNA (MoBio) optimizado para la plataforma automatizada Tecan. Para la secuenciación amplia, 100 ng de ADN purificado fueron fragmentados con un sonicador Covaris E220X. Fueron preparadas librerías compatibles con Illumina, como se describe (Zeevi et al., 2015), y secuenciados en la plataforma Illumina NextSeq con una longitud de reads de 80pb a una profundidad de 8,429,912 ± 5,568,845 reads (media ± DE). Dos muestras con < 1M reads fueron eliminadas de los análisis posteriores. Para la secuenciación genética del rARN 16S, se realizó una amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la región V3/4 utilizando la preparación genética del rARN 16S 515F/806R, seguida de una secuenciación de extremos emparejados de 500pb en la plataforma Illumina Miseq, a una profundidad de 77,872 ± 61,464 reads (media ± DE). Dos muestras no fueron analizadas debido a problemas técnicos del proceso de amplificación genética del rARN 16S. Dos muestras con menos de 30,000 reads fueron removidas para análisis posteriores. Todos los análisis 16S fueron realizados siguiendo sub muestreos de 30,000 reads.

Análisis del microbioma intestinal

Filtramos reads metagenómicos que contenían adaptadores Illumina, filtramos reads de mala calidad y recortamos las orillas de los reads de baja calidad utilizando Trimmomatic (Bolger et al., 2014). Detectamos el ADN del huésped representándolo con GEM (Marco-Sola et al., 2012) en el genoma humano (hg19) con parámetros incluyentes, y removimos esos reads. El análisis 16S fue realizado utilizando USearch8.0 (Edgar, 2013) utilizando los comandos fastq_mergepairs, derep_fulllength, sortbysize, out_radius_pct, uchime_ref, usearch_global, seguidos del script assign_taxonomy.py de QIIME (Caporaso et al., 2010).

Obtuvimos las abundancias relativas (RA) en la secuenciación metagenómica mediante MetaPhlAn2 (Truong et al., 2015) con parámetros por defecto. Asignamos las RA normalizadas por longitud de los genes, obtenidas mediante una representación similar con GEM en el catálogo de referencia (Li et al., 2014) en entradas del KEGG Orthology (KO) (Kanehisa and Goto, 2000), y estas fueron luego normalizadas para que sumaran 1. Las RAs derivadas de la secuenciación metagenómica fueron limitadas a 10−5, mientras que las RAs derivadas de la secuenciación del rARN 16S fueron limitadas a 10−4.

La PCoA fue calculada en la RA de las especies (metagenómica) o de las UTOs (16S), utilizando la disimilitud Bray-Curtis. La diversidad α para cada individuo fue calculada en la RA de las especies (metagenómica) o de las UTOs (16S), utilizando el índice Shannon. La diversidad β fue calculada utilizando la divergencia Bray-Curtis entre las muestras de origen y resultantes en cada semana de intervención y al inicio y al final del periodo de preparación de una prueba previa (Zeevi et al., 2015). Los únicos taxones presentes en al menos 10 muestras fueron incluidos en los análisis, excepto cuando se calculaba la diversidad α.

Cohorte de referencia

Aquí aparecen muestras analizadas del periodo de preparación de una prueba de intervención nutricional de (Zeevi et al., 2015), en la cual no se realizó ninguna intervención alimenticia. Para las muestras metagenómicas se utilizaron secuencias generadas previamente (Zeevi et al., 2015). Para la secuenciación del rARN 16S, se procesaron muestras nuevamente como se describe anteriormente. Sólo los sujetos que tenían más de tres muestras recolectadas fueron incluidos en el análisis en las Figuras 3A, 3E y S5A. Las características de base de todos los sujetos analizados se presentan en la Tabla S4.

Cuantificación y análisis estadístico

Análisis estadísticos

El análisis del efecto de tratamiento en la prueba cruzada y el cálculo del intervalo de confianza del 95% se realizó utilizando modelos lineales mixtos como fue recomendado (Mehrotra, 2014), utilizando la versión 9.4 de SAS, estimando el efecto de tratamiento con efectos fijos para el periodo, grupo de secuencia, la diferencia entre las medidas de origen en ambos periodos de intervención, y las interacciones entre esa diferencia y el periodo. No se incluyeron otras co variables en el modelo. Para el efecto del pan en el microbioma intestinal (Figuras 1E, 1F y S3), sólo se incluyeron en el análisis instancias (por ejemplo, género, módulo) con abundancia por encima del nivel límite observado en ambas semanas en al menos 15 sujetos. Los resultados fueron corregidos para la comprobación de múltiples hipótesis utilizando una FDR de 0.1  para cada nivel filogenético o funcional, de manera independiente. El análisis del efecto general del consumo de pan fue realizado utilizando la prueba de signos con rangos de Wilcoxon, corrigiendo los resultados para comprobación de hipótesis múltiples utilizando una FDR de 0.1.

Clasificación del tipo de pan que induce la PPGR

Empleamos un algoritmo estocástico de regresión de potenciación de gradiente, el cual fue apuntado hacia la diferencia entre las respuestas promedio al pan blanco integral, dividido entre la respuesta OGTT promedio, y probado contra la clasificación real a dos categorías de PPGRs menores al pan blanco e integral, utilizando la validación cruzada dejando uno fuera (CV). La predicción utilizada: (a) especies derivadas del análisis meta genómico (limitadas a 10−5), rutas y abundancias de módulos (corregidas a porcentaje de representación en el catálogo de genes de (Li et al., 2014)), de las cuales, 6 características no escasas fueron seleccionadas con base en la correlación de Pearson, con el valor objetivo en el conjunto de entrenamiento de cada iteración de CV; (b) cuatro componentes principales de composición de genes obtenidos al hacer una representación (Li et al., 2014), en el análisis de componentes principales calculado solamente sobre el conjunto de entrenamiento de cada iteración de CV; (c) el número de dichos genes presentes en las muestras; y (d) porcentaje de representación en el genoma humano, el catálogo de genes, y bases de datos de genomas bacterianos completos (Korem et al., 2015)

Medidas de la variabilidad interpersonal

Para calcular la proporción de la PPGR esperada para cada comida, para cada sujeto, promediamos la PPGR a cada comida estandarizada y dividimos este promedio entre su PPGR promedio a la glucosa:

Donde Rf(i) es la proporción de la respuesta del sujeto i al alimento f, y 

 es la PPGR promedio del  sujeto i al alimento f. Luego, calculamos esta proporción promedio en la población, excluyendo a dicho sujeto, es decir, este cálculo se realiza para cada sujeto, tomando en cuenta solamente a otros sujetos:

Donde n es el número total de sujetos que participan en el estudio es la proporción de la PPGR para el alimento f  utilizado para futuros cálculos con respecto al sujeto i.

Para calcular la respuesta esperada de cada persona a cada alimento, para cada sujeto calculamos,  la respuesta promedio del sujeto i a la glucosa, medida a lo largo de 6-8 mediciones. Estimamos la respuesta esperada al alimento f al multiplicar la respuesta promedio a la glucosa para cada sujeto por la proporción población-nivel de la PPGR para el alimento f excluyendo al sujeto en cuestión:

Estimamos la desviación estándar intra individual de la respuesta al alimento f, construyendo un modelo lineal RANSAC de la desviación estándar de la PPGR de los sujetos a la glucosa, dada su PPGR media a la glucosa. En este modelo lineal no ajustamos una intercepción (es decir, se requiere que por una PPGR de 0, la desviación estándar estimada sea 0). Utilizando este modelo lineal calculamos:

Done lm es el modelo lineal en cuestión.

Por lo tanto, la desviación estándar total esperada está dada por:

Donde es número de medidas de PPGR a la glucosa para el sujeto i.

La estandarización de la respuesta a la glucosa a cada alimento f fue realizada sustrayendo la respuesta esperada estimada al alimento, y dividiendo entre la desviación estándar estimada:

Donde  es la respuesta glucémica postprandial estandarizada de la persona i al alimento f. Bajo la hipótesis nula de ninguna variabilidad interpersonal, se espera que la distribución de sobre todos los alimentos entre todos los sujetos sea una distribución normal estándar, con media 0 y varianza 1.

Disponibilidad de los datos y el software

Los datos de secuenciación han sido depositados en el European Nucleotide Archive con accesión ENA: PRJEB17643. Todas las medidas de las variables resultantes están disponibles en la Tabla S5.

Fecha: Volumen 25, Edición 6, p1243–1253.e5, 6 junio de 2017

Link: http://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(17)30288-7

Autores: Tal Korem, David Zeevi, Niv Zmora, Omer Weissbrod, Noam Bar, Maya Lotan-Pompan, Tali Avnit-Sagi, Noa Kosower, Gal Malka, Michal Rein, Jotham Suez, Ben Z. Goldberg, Adina Weinberger, Avraham A. Levy, Eran Elinav, Eran Segal

Nota: Instituto Nutrigenómica no se hace responsable de las opiniones expresadas en el presente artículo.