DEBATE
En esta investigación, realizamos un estudio aleatorizado, controlado por placebos, de doble ciego en individuos recién diagnosticados con DT2 los cuales llevaban una dieta restringida en calorías, y demostramos que la metformina, y no la restricción calórica, tenía efectos rápidos en la composición y función de la microbiota intestinal y, en paralelo con la reducción del %HbA1c y de las concentraciones de glucosa sanguínea en ayuno. Una transferencia de microbiota a ratones libres de gérmenes mostró que la microbiota alterada por la metformina podía mejorar el metabolismo de la glucosa. Por otra parte, análisis del transcriptoma de heces cultivadas con metformina en un simulador del aparato intestinal in vitro mostraron que la metformina tenía efectos directos en la microbiota y regulaba la expresión de genes que codificaban metaloproteínas en las bacterias intestinales. Utilizando muestras acopladas en nuestro estudio en humanos a largo plazo, redujimos el efecto de las variaciones interindividuales, un problema común en estudios previos que investigaban el efecto de la metformina en la microbiota16, 17, 31.
Una fortaleza más de nuestro cohorte es que estos individuos habían sido diagnosticados recientemente con DT2 y por lo tanto, no estaban tomando otros fármacos para la DT2, sólo un pequeño número en cada grupo estaba tomando estatinas o terapia con anti hipertensores. también dimos seguimiento al consumo nutricional de los participantes antes y 4 meses después del tratamiento, y demostramos que la restricción calórica no afectaba el microbioma intestinal a ningún nivel en nuestro estudio; deberá hacerse la observación de que la reducción calórica presentada era leve, en relación con la de estudios previos que mostraban cambios profundos del microbioma intestinal en respuesta a una intervención nutricional22, 32. Por consiguiente, el diseño de nuestro estudio nos permitía minimizar el efecto de los factores de confusión principales que se sabe tienen un impacto en el microbioma intestinal. Al realizar la secuenciación amplia del genoma completo de las muestras fecales, observamos cambios importantes en la composición de la microbiota intestinal después de 2 y 4 meses con metformina en individuos recién diagnosticados con DT2.
De manera notable, estos cambios eran similares a los observados después de 6 meses con metformina en un subgrupo con placebos que cambió a metformina 6 meses después del inicio del estudio. En particular, observamos cambios considerables en la abundancia de Escherichia y Intestinibacter en todos los puntos de muestreo en el grupo tratado con metformina, un hallazgo que concuerda con resultados obtenidos en un estudio transversal que comparaba a grupos tratados y no tratados con metformina, de personas con DT217.
El crecimiento de E. coli en un análisis in vitro no fue afectado por la metformina. Por lo tanto, los efectos de la metformina en la abundancia de las especies de Escherichia son probablemente indirectos, y posiblemente, resultado de interacciones entre bacterias, o de otros cambios fisiológicos y/o ambientales en los intestinos al llevar un tratamiento con metformina. Demostramos que la metformina fomenta el crecimiento de B. adolescentis tanto in vivo (después de 2 meses en el estudio principal y después de 6 meses en el subgrupo modificado, como lo midió el PTR) e in vitro utilizando cultivos puros, y también, que incrementó la abundancia de Bifidobacterias en el grupo modificado. El suministro de B. adolescentis como suplemento en un modelo de roedores del síndrome metabólico ha mostrado previamente incrementar la sensibilidad a la insulina33. En nuestro cohorte, también observamos una correlación negativa entre el PTR de la B. adolescentis y el %HbA1c, lo cual sugiere que un mayor crecimiento de esta especie bacteriana podría potencialmente contribuir con el efecto antidiabético de la metformina.
Para observar las interacciones directas metformina–microbiota, incubamos muestras fecales de participantes sin tratamiento previo, con metformina en un simulador del aparato intestinal. En este sistema no observamos ningún cambio significativo en la E. coli o en la B. adolescentis. De hecho, el único taxón que se incrementó en respuesta a la metformina (a nivel tanto de ADN como de ARN y en muestras de dos donantes diferentes) fue la A. muciniphila. Se ha demostrado anteriormente que la metformina incrementa la abundancia de A. muciniphila en roedores a los que se da una dieta alta en grasas13-15, y este incremento en la abundancia ha sido relacionado con un mayor metabolismo de la glucosa13, 20, 21. Sin embargo, la evidencia de un vínculo entre la metformina y la A. muciniphila es menos claro en humanos16, 17. Observamos un incremento considerable en la abundancia de A. muciniphila en el tiempo, en los individuos que recibieron metformina durante 4 meses, pero sólo cuando utilizamos un análisis específico. De manera similar, un estudio reciente que analizó bacterias degradadoras de mucina y productoras de butirato mostró una mayor abundancia de A. muciniphila en humanos que tomaban metformina18. En concordancia con estas observaciones, demostramos que la metformina incrementaba el crecimiento de A. muciniphila in vitro utilizando cultivos puros. Sin embargo, es probable que el crecimiento de este taxón esté afectado en los humanos in vivo por factores que difieren entre individuos, tales como la disponibilidad de fibra34 y polifenoles35, 36, respuestas inmunes37, 38, y la edad39, 40.
Por otra parte, en nuestro estudio, no observamos correlaciones significativas entre el %HbA1c y la abundancia A. muciniphila, y por lo tanto, no podemos concluir que la A. muciniphila es el factor que más contribuye a los efectos beneficiosos de la metformina en nuestro cohorte humano. Al comparar resultados de los análisis de metagenómica in vivo y los análisis de metagenómica y metatranscriptómica in vitro, observamos que la metformina fomentaba cambios consistentes en las funciones microbianas, incluyendo la biosíntesis de LPS y el metabolismo de los SCFAs.
Una mayor biosíntesis de LPS podría reflejar una mayor abundancia de bacterias gram negativas tales como Proteobacterias, pero no fue relacionada con una mayor inflamación sistémica, puesto que la proteína C reactiva no se vio alterada (Tabla 1). De manera similar, el enriquecimiento de la ruta de biosíntesis de LPS sin un incremento de inflamación ha sido observado tanto en humanos después de cirugía bariátrica41, como en ratones tratados con prebióticos, a los que se daba una dieta alta en grasas42. También se ha pronosticado un mayor metabolismo de los SCFAs en respuesta a la metformina en los primeros análisis metagenómicos en humanos17, 18, y en concordancia, nuestro análisis metabolómico específico demostró que la metformina incrementaba de manera considerable el butirato y propionato en hombres. Un análisis detallado del transcriptoma de los efectos de la metformina en dos especies bacterianas emparentadas de manera distante en el simulador intestinal, mostró que la mayoría de los genes regulados por la metformina codificaban metaloproteínas o transportadores metálicos. Es poco probable que las respuestas transcripcionales de este conjunto de genes se debiera a un incremento de las transcripciones totales inducido por el crecimiento, ya que la mayoría de estos genes eran regulados por la metformina.
De manera interesante, se sabe que algunos metales contribuyen con la pato fisiología de la DT243, y se sabe desde hace muchos años que la metformina se une a los metales44. Por otra parte, un estudio reciente mostró que los efectos de la metformina en la línea celular del hígado de un mamífero son dependientes de las propiedades de unión a metales de este fármaco44. Sin embargo, nuestro estudio, a nuestro entender, está entre los primeros en indicar un vínculo entre la metformina y las proteínas que tienden a realizar uniones con metales, producidas por la microbiota intestinal.
La transferencia de materia fecal a ratones libres de gérmenes dio como resultado una mayor tolerancia a la glucosa en los receptores de microbiota alterada por la metformina, de dos de los tres donantes, con un incremento sustancial general del metabolismo de la glucosa; indicando de esta forma que la microbiota adaptada a la metformina podría contribuir con los efectos beneficiosos de la metformina en la homeóstasis de la glucosa. No resulta claro por qué las respuestas a la microbiota alterada por la metformina diferían entre los donantes, dado que todos ellos mostraron una mayor tolerancia a la glucosa después de 2 y 4 meses de tratamiento con metformina. Sin embargo, hay grandes diferencias interindividuales en la composición de la microbiota intestinal en humanos, y la falta de respuesta de la microbiota de un donante podría ser atribuible a una transferencia incompleta de especies clave, como se ha descrito previamente45. Por otro lado, las dietas diferentes de los ratones receptores y de los donantes humanos (alta en grasas, en contraste con restricción calórica), muy probablemente exacerbaría diferencias en la composición de la microbiota intestinal entre los donantes y los receptores. Los taxones que son transferidos de manera exitosa a los ratones receptores serán, por lo tanto, dependientes no sólo de la composición de la microbiota intestinal del donante, sino también de qué tan bien los taxones responden a los diferentes macro nutrientes.
Existen cada vez más evidencias para indicar que los SFCAs y los ácidos biliares juegan un rol en la regulación de la homeostasis de la glucosa26, 27, 46, 47, y recientemente mostramos que el ácido succínico producido por la microbiota podía mejorar el metabolismo de la glucosa al activar la glucogénesis intestinal en ratones 48. Aquí, observamos alteraciones inducidas por la metformina en estos metabolitos regulados microbianamente, lo cual sugiere que estos podrían ser parcialmente responsables del efecto reductor de glucosa incrementado que se ha observado cuando se administra metformina de forma oral, en contraste con una inyección intravenosa11. Se debe recalcar que no podemos concluir que el mecanismo de acción más importante de la metformina sea a través de la microbiota. Por ejemplo, un estudio reciente en ratones mostró que la fosforilación de las acetil-CoA carboxilasas (ACC) 1 y 2 por la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) se requiere para observar los efectos sensibilizadores a la insulina de la metformina5, demostrando la importancia de las señales de AMPK/ACC.
Sin embargo, es posible que la microbiota intestinal también pueda actuar a través de las ACCs, dado que previamente demostramos que la obesidad inducida por la dieta involucraba interferencias entre la microbiota, la AMPK, y la fosforilación de la ACC249. En resumen, nuestro trabajo muestra que la metformina interactúa con diferentes bacterias intestinales, posiblemente a través de la regulación de la homeostasis de los metales. Sin embargo, estudios adicionales que combinen metabolómica y metaproteómica no específica, son esenciales para identificar más metabolitos o proteínas microbianas y para determinar la forma en que estas interactúan con los blancos del huésped para mejorar su metabolismo.
REFERENCIAS
- Nathan, D.M. et al. Medical management of hyperglycemia in type 2 diabetes: a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy: a consensus statement of the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes. Diabetes Care 32, 193–203 (2009).2. Pernicova, I. & Korbonits, M. Metformin—mode of action and clinical implications for diabetes and cancer. Nat. Rev. Endocrinol. 10, 143–156 (2014).3. Zhou, G. et al. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action. J. Clin. Invest. 108, 1167–1174 (2001).4. Shaw, R.J. et al. The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin. Science 310, 1642–1646 (2005).5. Fullerton, M.D. et al. Single phosphorylation sites in Acc1 and Acc2 regulate lipid homeostasis and the insulin-sensitizing effects of metformin. Nat. Med. 19, 1649–1654 (2013).6. Foretz, M. et al. Metformin inhibits hepatic gluconeogenesis in mice independently of the LKB1/AMPK pathway via a decrease in hepatic energy state. J. Clin. Invest. 120, 2355–2369 (2010).7. Madiraju, A.K. et al. Metformin suppresses gluconeogenesis by inhibiting mitochondrial glycerophosphate dehydrogenase. Nature 510, 542–546 (2014).8. Miller, R.A. et al. Biguanides suppress hepatic glucagon signalling by decreasing production of cyclic AMP. Nature 494, 256–260 (2013).
© 2017 Nature America, Inc., part of Springer Nature. All rights reserved.a r t i c l e snature medicine ADVANCE ONLINE PUBLICATION 99. McCreight, L.J., Bailey, C.J. & Pearson, E.R. Metformin and the gastrointestinal tract. Diabetologia 59, 426–435 (2016).10. Duca, F.A. et al. Metformin activates a duodenal Ampk-dependent pathway to lower hepatic glucose production in rats. Nat. Med. 21, 506–511 (2015).11. Stepensky, D., Friedman, M., Raz, I. & Hoffman, A. Pharmacokinetic-pharmacodynamic analysis of the glucose-lowering effect of metformin in diabetic rats reveals first-pass pharmacodynamic effect. Drug Metab. Dispos. 30, 861–868 (2002).12. Buse, J.B. et al. The primary glucose-lowering effect of metformin resides in the gut, not the circulation. Results from short-term pharmacokinetic and 12-week dose-ranging studies. Diabetes Care 39, 198–205 (2016).13. Shin, N.R. et al. An increase in the Akkermansia spp. population induced by metformin treatment improves glucose homeostasis in diet-induced obese mice. Gut 63, 727–735 (2014).14. Zhang, X. et al. Modulation of gut microbiota by berberine and metformin during the treatment of high-fat diet-induced obesity in rats. Sci. Rep. 5, 14405 (2015).15. Lee, H. & Ko, G. Effect of metformin on metabolic improvement and gut microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5935–5943 (2014).16. Karlsson, F.H. et al. Gut metagenome in European women with normal, impaired and diabetic glucose control. Nature 498, 99–103 (2013).17. Forslund, K. et al. Disentangling type 2 diabetes and metformin treatment signatures in the human gut microbiota. Nature 528, 262–266 (2015).18. de la Cuesta-Zuluaga, J. et al. Metformin is associated with higher relative abundance of mucin-degrading Akkermansia muciniphila and several short-chain fatty acid–producing microbiota in the gut. Diabetes Care 40, 54–62 (2017).19. Karlsson, F.H., Nookaew, I. & Nielsen, J. Metagenomic data utilization and analysis (MEDUSA) and construction of a global gut microbial gene catalogue. PLoS Comput. Biol. 10, e1003706 (2014).20. Everard, A. et al. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 9066–9071 (2013).21. Plovier, H. et al. A purified membrane protein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacterium improves metabolism in obese and diabetic mice. Nat. Med. 23, 107–113 (2017).22. Dao, M.C. et al. Akkermansia muciniphila and improved metabolic health during a dietary intervention in obesity: relationship with gut microbiome richness and ecology. Gut 65, 426–436 (2016).23. Park, S.K., Kim, M.S., Roh, S.W. & Bae, J.W. Blautia stercoris sp. nov., isolated from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62, 776–779 (2012).24. Korem, T. et al. Growth dynamics of gut microbiota in health and disease inferred from single metagenomic samples. Science 349, 1101–1106 (2015).25. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28, 27–30 (2000).26. Wong, J.M., de Souza, R., Kendall, C.W., Emam, A. & Jenkins, D.J. Colonic health: fermentation and short chain fatty acids. J. Clin. Gastroenterol. 40, 235–243 (2006).27. Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P. & Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell 165, 1332–1345 (2016).28. Ridlon, J.M., Harris, S.C., Bhowmik, S., Kang, D.J. & Hylemon, P.B. Consequences of bile salt biotransformations by intestinal bacteria. Gut Microbes 7, 22–39 (2016).29. Caspary, W.F. et al. Alteration of bile acid metabolism and vitamin-B12-absorption in diabetics on biguanides. Diabetologia 13, 187–193 (1977).30. Scarpello, J.H., Hodgson, E. & Howlett, H.C. Effect of metformin on bile salt circulation and intestinal motility in type 2 diabetes mellitus. Diabet. Med. 15, 651–656 (1998).31. Zhernakova, A. et al. Population-based metagenomics analysis reveals markers for gut microbiome composition and diversity. Science 352, 565–569 (2016).32. Cotillard, A. et al. Dietary intervention impact on gut microbial gene richness. Nature 500, 585–588 (2013).33. Chen, J., Wang, R., Li, X.F. & Wang, R.L. Bifidobacterium adolescentis supplementation ameliorates visceral fat accumulation and insulin sensitivity in an experimental model of the metabolic syndrome. Br. J. Nutr. 107, 1429–1434 (2012).34. Desai, M.S. et al. A dietary fiber-deprived gut microbiota degrades the colonic mucus barrier and enhances pathogen susceptibility. Cell 167, 1339–1353.e21 (2016).35. Roopchand, D.E. et al. Dietary polyphenols promote growth of the gut bacterium Akkermansia muciniphila and attenuate high-fat diet-induced metabolic syndrome. Diabetes 64, 2847–2858 (2015).36. Anhê, F.F. et al. A polyphenol-rich cranberry extract protects from diet-induced obesity, insulin resistance and intestinal inflammation in association with increased Akkermansia spp. population in the gut microbiota of mice. Gut 64, 872–883 (2015).37. Greer, R.L. et al. Akkermansia muciniphila mediates negative effects of IFNγ on glucose metabolism. Nat. Commun. 7, 13329 (2016).38. Zhang, H., Sparks, J.B., Karyala, S.V., Settlage, R. & Luo, X.M. Host adaptive immunity alters gut microbiota. ISME J. 9, 770–781 (2015).39. Collado, M.C., Derrien, M., Isolauri, E., de Vos, W.M. & Salminen, S. Intestinal integrity and Akkermansia muciniphila, a mucin-degrading member of the intestinal microbiota present in infants, adults, and the elderly. Appl. Environ. Microbiol. 73, 7767–7770 (2007).40. Kong, F. et al. Gut microbiota signatures of longevity. Curr. Biol. 26, R832–R833 (2016).41. Tremaroli, V. et al. Roux-en-Y gastric bypass and vertical banded gastroplasty induce long-term changes on the human gut microbiome contributing to fat mass regulation. Cell Metab. 22, 228–238 (2015).42. Everard, A. et al. Microbiome of prebiotic-treated mice reveals novel targets involved in host response during obesity. ISME J. 8, 2116–2130 (2014).43. Fernández-Real, J.M. & Manco, M. Effects of iron overload on chronic metabolic diseases. Lancet Diabetes Endocrinol. 2, 513–526 (2014).44. Logie, L. et al. Cellular responses to the metal-binding properties of metformin. Diabetes 61, 1423–1433 (2012).45. Wahlström, A. et al. Induction of farnesoid X receptor signaling in germ-free mice colonized with a human microbiota. J. Lipid Res. 58, 412–419 (2017).46. Wahlström, A., Sayin, S.I., Marschall, H.U. & Bäckhed, F. Intestinal crosstalk between bile acids and microbiota and its impact on host metabolism. Cell Metab. 24, 41–50 (2016).47. Schaap, F.G., Trauner, M. & Jansen, P.L. Bile acid receptors as targets for drug development. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 11, 55–67 (2014).48. De Vadder, F. et al. Microbiota-produced succinate improves glucose homeostasis via intestinal gluconeogenesis. Cell Metab. 24, 151–157 (2016).49. Bäckhed, F., Manchester, J.K., Semenkovich, C.F. & Gordon, J.I. Mechanisms underlying the resistance to diet-induced obesity in germ-free mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 979–984 (2007).
MÉTODOS EN LÍNEA
Diseño del estudio clínico. 40 individuos con DT2 fueron reclutados y aleatorizados (utilizando un generador aleatorio computacional Aleator) para un tratamiento con metformina (n = 22) o placebo (n = 18) durante 4 meses. La metformina (Acyfabrik, Madrid, España) se comenzó a suministrar a una dosis de 425 mg/día y se incrementó progresivamente durante la primera semana para alcanzar 1700 mg/día (en tres dosis). Se instruyó a ambos grupos para que mantuvieran un consumo calórico diario reducido de 500 kcal durante el tratamiento completo. Recomendamos una dieta hipocalórica de 25 kcal/kg o 20 kcal/kg y utilizamos un cuestionario validado de frecuencia alimenticia50. La composición de la dieta era 15% de proteínas, 30% de grasas (<10% gracias saturadas), 55% de carbohidratos, y de 20 a 25 g de fibra dietética (Tabla Suplementaria 1). También se sugirieron cambios en el estilo de vida, incluyendo actividad física regular (150 min/semana). Recolectamos muestras tanto fecales como de plasma en el punto de partida y a los 2 y 4 meses después del tratamiento. A un subgrupo de los individuos que estaban con placebos se cambió a un tratamiento con metformina después de 6 meses de la intervención alimenticia (850 o 1,700 mg/d, n = 13); obtuvimos muestras fecales y plasmáticas de estos individuos después de 6 meses más. Las personas en este grupo no fueron seleccionadas al azar, sin embargo, acordaron recibir tratamiento con metformina. Se dio seguimiento al cumplimiento y a los efectos secundarios en cada visita. Los criterios de inclusión fueron: (i) edad entre 18 y 65 años; (ii) diagnóstico de DT2 en los 6 meses anteriores, de acuerdo a como lo definen los criterios de la Asociación Americana de Diabetes51; (iii) ausencia de enfermedades sistémicas y metabólicas diferentes a la DT2, y ausencia de infección durante el mes anterior; (iv) ausencia de dieta o medicación que pudiera interferir con la homeostasis de la glucosa, como glucocorticoides o antibióticos durante los 3 meses anteriores; y (v) HbA1c menor al 9%.
Los criterios de exclusión fueron: (i) enfermedad sistémica de consideración, incluyendo la propensión a desarrollar progresión de enfermedades; (ii) evidencia clínica de hemoglobinopatías o anemia; (iii) historial de abuso de drogas o alcohol, definido como >80 g/d en hombres y >40 g/d en mujeres; (iv) evento cardiovascular agudo en los 6 meses anteriores; (v) enfermedades agudas o evidencia actual de enfermedad inflamatoria o infecciosa, crónica o aguda; y (vi) enfermedad mental que hiciera a los participantes incapaces de entender la naturaleza, alcance y posibles consecuencias del estudio. Todos los individuos dieron su consentimiento informado por escrito. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética y el Comité para la Investigación Clínica del Hospital Universitario Dr. Josep Trueta (Girona, España). Certificamos que todas las normas institucionales aplicables con relación al uso ético de la información y las muestras de voluntarios humanos fueron respetadas durante esta investigación. El registro completo de las pruebas clínicas se encuentra en el registro de pruebas clínicas de la UE (EudraCT número 2010-022394-34).
Extracción de la secuenciación amplia de ADN genómico fecal y de genoma completo
Se extrajo ADN genómico fecal de 100 mg de heces congeladas utilizando el equipo QIAamp DNA mini stool kit (Qiagen, Courtaboeuf, Francia), realizando un golpeteo repetido con micro esferas (6,500 r.p.m., 3 × 30 s). El ADN fue extraído de 131 muestras fecales, obtenidas de los participantes en tres diferentes puntos temporales durante el estudio (n = 118; no se obtuvieron dos de las muestras fecales) y de 13 participantes cuyas muestras fueron añadidas 6 meses después de cambiar a un tratamiento con metformina. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 300 pb fueron secuenciados en el instrumento Illumina NextSeq 500 (150 pb; extremos emparejados) en el Genomics Core Facility de la Academia Sahlgrenska, de la Universidad de Gotemburgo.
Análisis metagenómicos
Obtuvimos un total de 941 Gb de lecturas brutas de extremos emparejados. La composición taxonómica y de KO fue obtenida utilizando una versión actualizada del conducto MEDUSA19, en el cual las lecturas en bruto fueron editadas por FASTX (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/; con un umbral de calidad de 20 pb y una longitud mínima de 35 pb), filtradas para remover las lecturas humanas (versión hg19), y luego representadas en catálogos de genes y genomas bacterianos utilizando Bowtie2 (ref. 52). Se aplicó un filtro adicional el durante el proceso de representación, que contenía lecturas con al menos 95% de identidad para obtener lecturas de alta calidad. Las proporciones medias de representación para los catálogos de genomas y genes eran de 36.6% y 64.6%, respectivamente (Tabla Suplementaria 2). La composición taxonómica y la matriz de perfil KO obtenidas fueron analizadas adicionalmente por DESeq2 package53. Los análisis de enriquecimiento de rutas se basan en la anotación KEGG25 y en la prueba hipergeométrica utilizando goseq54.
La diversidad beta y el análisis PCoA fueron calculados en base a la abundancia relativa de todos los KOs relevantes (posteriormente transformados por su raíz cuadrada para reducir la influencia de KOs dominantes, como ha sido sugerido anteriormente55) utilizando phyloseq (versión 1.12.2)56. El análisis de red de coabundancia género-género se basó en la correlación de Spearman. Sólo fueron utilizados para el análisis de correlación, géneros presentes en al menos 80% de las muestras, y sólo se utilizaron conexiones con un valor de rho mayor a 0.6, o menor a -0.6, para la construcción y visualización de redes, con base a igraph57. Para la estimación de PTRs, se representaron lecturas metagenómicas en una base de datos local de genomas que contenía ~200 cepas bacterianas humanas comunes, utilizando el software PTRC24.
Para el análisis de los genes de hidrolasa de sales biliares (bsh), se construyó una base de datos local de genes que contenía todos los genes bsh disponibles mediante la comparación58 contra genes de referencia NCBI59, catálogo de genes MEDUSA19, y el catálogo de genes integrado para el microbioma humano (IGC)60, utilizando 16 genes bsh semilla seleccionados aleatoriamente (gi: 169212173, 47121626, 488267184, 489835719, 491501450, 491807128, 499725619, 503743756, 524844235, 558633790, 654788256, 753801014, 759977951, 814507153, 823277295 and 933135484). Luego, la base de datos local de genes bsh fue utilizada para lecturas específicas examinadas con base al conducto MEDUSA19.
Análisis metabolómicos específicos
Se midieron los SCFAs fecales utilizando cromatografía de gases en combinación con detección de espectrometría de masa (GC–MS), como se ha descrito anteriormente61. En síntesis, aproximadamente de 50 a 200 mg de heces fueron mezcladas con estándares internos, añadidas a ampollas de vidrio y secadas a bajas temperaturas. Luego, todas las muestras fueron acidificadas con HCl, y se extrajeron los SCFAs con dos tandas de extracción con éter dietílico. El sobrenadante orgánico fue recolectado, el agente de derivatización N-tert-butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida (Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suecia) fue añadido, y se incubaron muestras durante la noche. Los SCFAs fueron cuantificados con un cromatógrafo de gases 7090A en combinación con un espectrómetro de masa 5975C (Agilent Technologies 5975C, Santa Clara, CA). Los estándares de SCFAs fueron obtenidos de Sigma-Aldrich (Estocolmo, Suecia).
Se analizaron los ácidos biliares utilizando cromatografía de líquidos de rendimiento superior en conjunto con espectrometría de masa tándem (UPLC–MS/MS), como se ha descrito antes41. En resumen, se extrajeron los ácidos biliares del plasma utilizando precipitación de proteínas con diez volúmenes de metanol que contenían estándares internos. Después de la mezcla y centrifugación, las muestras fueron evaporadas y reconstituidas en 200 µl de metanol:agua (1:1) para su análisis. Para las heces, aproximadamente 50 mg de muestras fueron colocadas en un tubo de polipropileno de 2 ml junto con 6 micro esferas cerámicas (3 mm; Retsch GmbH, Haan, Alemania) y 500 µl de estándar interno que contenía metanol. Las heces fueron homogeneizadas y centrifugadas, y el sobrenadante fue diluido 10 veces en metanol:agua (1:1) antes de su análisis. Los ácidos biliares fueron separados utilizando una columna Kinetex C18 (2.1 × 100 mm con 1.7-µm partículas) (Phenomenex, Torrance, CA, EEUU) mantenida a 60 °C. Las fases móviles consistieron en agua con 7.5-mM de acetato de amonio y 0.019% de ácido fórmico (pH 4.5) como fase móvil A, y acetonitrilo con 0.1% de ácido fórmico como fase B. Se utilizó para la detección, un intrumento QTRAP 5500 (Sciex, Toronto, Canadá), utilizando monitoreo de reacciones múltiples en modo negativo. Los estándares de ácido biliar fueron obtenidos de Sigma-Aldrich (Estocolmo, Suecia), CDN Isotopes (Quebec, Canadá), y Toronto Research Chemicals (Downsview, Ontario, Canadá).
Procedimientos en animales
Los procedimientos en animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Gotemburgo. Para los experimentos de trasplantes de microbiota fecal, utilizamos ratones machos Swiss Webster libres de gérmenes de 10 a 12 semanas de edad. Los ratones fueron mantenidos en jaulas individualmente ventiladas (ISOcage N System, Tecniplast, Buguggiate, Italia), con un máximo de cinco ratones por jaula. Se les dio agua a voluntad. 500 mg de heces congeladas obtenidas en el punto de partida (M0) y 4 meses después del tratamiento con metformina (M4) de tres individuos, fueron suspendidas en 5 ml de tampón fosfato salino reducido que contenía 0.2 g/litro de Na2S y 0.5 g/ litro de cisteína como agentes reductores. Los tres donantes fueron elegidos de la rama de metformina del estudio clínico aleatorizado, quienes mostraron una reducción en el %HbA1c después de 2 y 4 meses de tratamiento con metformina, y las muestras de heces individuales no fueron mezcladas. Los ratones libres de gérmenes fueron aleatorizados en dos grupos y colonizados mediante administración oral por sonda con 200 µl de M0/M4 de heces líquidas de cada donante. A los ratones se les dio una dieta irradiada alta en grasas (40% kcal de grasas, TD09683, Harlan Teklad) durante una semana antes y durante los 18 días de colonización. La composición corporal fue determinada con un instrumento EchoMRI (EchoMRI) 1 día después de la colonización y al final del experimento. La insulina fue medida con un equipo de Crystal Chem (Downers Grove, IL) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se realizó una prueba intraperitoneal de tolerancia a la glucosa al final del experimento, como se ha descrito previamente62. A los investigadores no se les impidió ver la distribución de los grupos. Ningún ratón fue excluido de este estudio.
Experimentos de crecimiento bacteriano in vitro
Pre cultivos de B. adolescentis L2-32 y E. coli fueron inoculados anaeróbicamente en una cámara Coy (5% de hidrógeno, 10% de dióxido de carbono, y 85% de nitrógeno) como colonias individuales en 7 ml de medio infusión de sesos-corazón (BHI) que contenía (en g/litro) extracto de levadura (5), celobiosa (1), maltosa (1), cisteína (0.5) y hemina (0.01). Para la A. muciniphila se utilizó una infusión BHI modificada, a la cual se añadieron cisteína (0.05%) y mucina tipo II (1%). Antes de la inoculación, el medio modificado fue filtrado utilizando un filtro de 0.22 µm. Después de la incubación durante 14 horas, cada pre cultivo fue inoculado en una infusión BHI recién preparada o infusión BHI modificada, con o sin metformina en un plato con 24 cavidades, o en un micro plato con 96 cavidades a una concentración(v/v) of 0.5% de E. coli o 1% de B. adolescentis en un volumen de 2.5 ml y 2% de A. muciniphila en un volumen de 300 µl. El efecto de la metformina en la cinética del crecimiento bacteriano fue analizado en un lector de microplacas CLARIOstar equipado con una unidad de control atmosférico (BMG Labtech), siguiendo la densidad óptica (OD600). La concentración de oxígeno atmosférico fue reducida a 0.1% y fue mantenida con nitrógeno como gas base. Los datos de la curva de crecimiento a lo largo de 10 horas para la E. coli y la B. adolescentis y a lo largo de 30 h para la A. muciniphila fueron analizados utilizando el software de análisis de datos MARS (BMG Labtech).
Simulador intestinal in vitro
Se utilizó un modelo simulado de reducción-oxidación de un intestino humano (SHRIM) para explorar el efecto de la metformina en una comunidad microbiana intestinal estabilizada in vitro. SHRIM es un fermentador de dos cámaras con una cámara luminal anaeróbica (250 ml) y un alimentador de oxígeno (100 ml), los cuales están separados por una membrana de Nafion N115 (DuPont, EEUU; diámetro 2.5 cm) y continuamente purgadas con nitrógeno y oxígeno, respectivamente. La cámara luminal era continuamente rotada a 250 revoluciones por minuto y mantenida a 37 °C. El alimentador de oxígeno contenía un tampón de 100-mM de fosfato de potasio. La cámara luminal fue sembrada con 250 ml de alimentos que contenían: (en g/litro) arabinogalactan (1.0), pectina (2.0), xilosa (1.5), almidón (0.3), glucosa (0.4), extracto de levadura (0.3), peptona (1.0), mucina tipo II (4.0), y cisteína (0.5). Para estimular los procesos de digestión, el alimento fue acidificado hasta aproximadamente un pH de 2 con 6-M HCl, y neutralizado con jugo pancreático simulado a un pH de aproximadamente 6.9. El jugo pancreático simulado contenía: (en g/litro) NaHCO3 (12.5), sales biliares de bilis de buey (6.0), y pancreatina (0.9). La mezcla de alimento y jugo pancreático (70:30), denominado como alimento SHRIM, fue mantenido anaeróbico mediante el purgado continuo con nitrógeno63. El alimento SHRIM fue dosificado continuamente a la cámara luminal a una velocidad que daba un tiempo de retención de aproximadamente 24 horas, y el pH fue mantenido entre 6.9 y 6.6 con un controlador de pH y una bomba dosificadora (Black stone BL7912, Hanna Instruments, RU). El sistema SHRIM fue inoculado con una alícuota de la muestra fecal M0 de cada donante de manera individual. Se preparó un pre cultivo de forma anaeróbica en una cámara Coy (5% de hidrógeno, 10% de dióxido carbono, y 85% de nitrógeno) añadiendo 2% de materia fecal a una infusión BHI de 5 ml como se ha descrito anteriormente. El pre cultivo fue incubado durante 3 horas a 37 °C, y 2% del pre cultivo fue sembrado en el compartimento luminal de sistema SHRIM.
Análisis de metagenoma y metatranscriptoma de la comunidad microbiana en el simulador intestinal in vitro
Después de una semana de estabilización, la comunidad microbiana fue probada con 10-mM de metformina continuamente, y se tomaron muestras (2 × 1 ml) en el punto de partida (tiempo cero) y después, diariamente durante 1 semana. Después de una centrifugación a 16,000 revoluciones por minuto durante 2 minutos a 4 °C, la micro esfera celular fue suspendida en 1 ml de tampón Tris-EDTA (mM Tris, 1-mM EDTA pH 7.5), y se utilizaron 500-µl de alícuota para extracciones de ADN y ARN. El ADN total fue extraído mediante un golpeteo repetido de micro esferas, como se ha explicado anteriormente64. El ARN total fue extraído de acuerdo con el protocolo de aislamiento de Macaloides utilizando los tubos pesados Phase Lock Gel (5 Prime GmbH) y el mini equipo RNAeasy con un tratamiento DNAseI en columnas (Qiagen) para purificación, como se ha descrito previamente65, 66. Se realizó una secuenciación del genoma completo tanto en ADN como en ARN aislado del simulador intestinal en el punto de partida y después de 1 día y 7 días del tratamiento con metformina en un instrumento Illumina NextSeq 500 en el Genomics Core Facility en la Academia Sahlgrenska, de la Universidad de Gotemburgo.
Se generaron en promedio 21.6 millones de lecturas de ADN 150 pb de extremos emparejados, y 35.2 millones de lecturas de ARN 75 pb de extremos emparejados, de ambos donadores para un análisis del metagenoma y el metatranscriptoma, respectivamente. Se prepararon bibliotecas para la secuenciación del metagenoma como se ha mencionado anteriormente. Se prepararon bibliotecas para la secuenciación del metatranscriptoma, para el RNA total del rRNA agotado, utilizando el equipo TruSeq Stranded Total RNA Library Preparation kit (Illumina).
El rRNA fue agotado utilizando el equipo Ribo-Zero rRNA Removal Kit para bacterias gram positivas y gram negativas (Illumina). Luego, el conducto MEDUSA19 fue utilizado para obtener la composición taxonómica y los perfiles KO funcionales, como se ha descrito, para el análisis metagenómico. Además, para analizar el perfil de la expresión génica de la A. muciniphila y la B. wadsworthia, se descargó del NCBI (número de adquisición NC_010655.1 y NZ_ADCP00000000.2, respectivamente) una base de datos local de genes que contenía solamente genes de estas dos bacterias.
El diagrama de cuerdas fue producido utilizando el R package circlize67. El enriquecimiento de GO fue realizado utilizando R package STRINGdb (versión 1.10.0)68.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos fueron realizados en el entorno R69. Se logró una potencia de 97% utilizando pwr package70 para este estudio, con base en 22 individuos, con diseño emparejado, 5% de relevancia, y un tamaño estimado del efecto de 0.87 para la metformina en el mejoramiento de la glucosa sanguínea en ayuno71. Debido a que el objetivo principal de nuestro estudio aleatorizado controlado era investigar el efecto de la metformina en la composición y función de la microbiota intestinal, no realizamos un cálculo poderoso para el placebo en relación con los grupos de metformina, puesto que el tamaño del efecto de la metformina junto con una dieta restringida en calorías en la microbiota era anteriormente desconocido. Para las pruebas en animales, el tamaño de la muestra fue elegido en base a nuestra experiencia previa y no se utilizó ninguna prueba estadística para determinar el tamaño de la muestra.
Se utilizó la prueba de Wald con diseño emparejado implementada en DESeq2 (ref. 53) para los análisis diferenciales de abundancia para todos los datos de conteo (en el caso tanto de los metagenómicos como de los metatranscriptómicos). Se utilizó la correlación de orden de rangos de Spearman para determinar la fuerza y dirección de las relaciones monótonas entre dos variables, a menos que se observara colinealidad fuerte, en cuyo caso se calculaba la correlación de producto-momento de Pearson. Se realizó un análisis de múltiples variables con la prueba Adonis en base a 5,000 permutaciones, utilizando vegan72. Se examinaron las pruebas estadísticas para las velocidades de crecimiento bacteriano mediante ANOVAS de dos factores con mediciones repetidas basadas en seis reproducciones técnicas.
Los cambios en las concentraciones de SCFAs entre los grupos de metformina y placebos fueron comparados mediante regresión lineal ajustada para el IMC, género, y consumo de fibra; el mismo procedimiento fue utilizado para los ácidos biliares, excepto que los datos fueron ajustados para el consumo total de calorías en vez del consumo de fibra. En cualquier otro caso, se utilizaron pruebas de sumas de rangos de Wilcoxon, o pruebas de rangos con signo de Wilcoxon en todo el estudio, dependiendo de si las muestras estaban emparejadas. Los valores brutos de P fueron ajustados mediante el método Benjamini–Hochberg73 con una tasa de falso descubrimiento del 5%, a menos que se indicase de otra forma.
Fecha: publicado en línea 22 de mayo de 2017
Autores: Hao Wu, Eduardo Esteve, Valentina Tremaroli, Muhammad Tanweer Khan, Robert Caesar, Louise Mannerås-Holm, Marcus Ståhlman, Lisa M Olsson, Matteo Serino, Mercè Planas-Fèlix, Gemma Xifra, Josep M Mercader, David Torrents, Rémy Burcelin, Wifredo Ricart, Rosie Perkins, José Manuel Fernàndez-Real & Fredrik Bäckhed
Nota: Instituto Nutrigenómica no se hace responsable de las opiniones expresadas en el presente artículo.
