La metformina fomenta cambios funcionales en el microbioma intestinal
Para investigar más a fondo los cambios funcionales en el microbioma intestinal después del tratamiento con metformina, anotamos los genes a la enciclopedia Kyoto de homología (KO) de genes y genomas (KEGG)25. Sólo dos KOs fueron alterados de manera considerable durante los 4 meses del periodo de estudio en el grupo de placebos (FDR < 0.05). En contraste, 626 y 473 KOs fueron incrementados, mientras que 130 y 69 KOs fueron disminuidos después de 2 y 4 meses con metformina, respectivamente (Fig. Suplementaria 3 y Tabla Suplementaria 4; FDR < 0.05), y la mayoría de los cambios fueron consistentes entre los dos momentos de muestreo (Fig. Suplementaria 3). El análisis de coordenadas principales (PCoA) de la abundancia relativa de todos los KOs alterados significativamente reveló funciones génicas similares en el grupo de placebos en todos los puntos de tiempo y el grupo de metformina en el punto de partida (es decir, antes del tratamiento), pero observamos cambios considerables después del tratamiento con metformina durante 2 y 4 meses (Fig. 4a). El análisis de enriquecimiento de rutas reveló que el tratamiento con metformina estaba relacionado principalmente con el enriquecimiento de genes para las respuestas ambientales bacterianas (por ejemplo, sistema de secreción bacteriana, sistema de dos componentes, y transportadores ABC), resistencia a fármacos (quimiotaxis bacteriana y resistencia antimicrobiana catiónica a los péptidos), metabolismo Central de carbohidratos (sistema de fosfotransferasa, metabolismo de ácido pirúvico, butirato, y propionato), metabolismo de aminoácidos, biosíntesis de lipopolisacáridos (LPS) (Fig. 4b y Tabla suplementaria 4; FDR < 0.05).
Aunque no resulta clara la forma en que las alteraciones en la microbiota intestinal fomentan efectos beneficiosos en el huésped, un mecanismo potencial comprendería una mayor producción de ácidos grasos de cadena corta (SCFAs), principalmente acetato, propionato, butirato y otros ácidos orgánicos26, 27. Por lo tanto, realizamos metabolómica específica para investigar si el enriquecimiento observado en los genes para el metabolismo de los SCFAs en el microbioma intestinal a raíz del tratamiento con metformina se relacionaba paralelamente con una mayor producción de SCFAs. Observamos incrementos considerablemente mayores en concentraciones de propionato y butirato fecales en el grupo de metformina, en comparación con el grupo de placebos, después de 4 meses de tratamiento en hombres; sin embargo, no se observaron diferencias cuando se combinaron los resultados de hombres y mujeres (Fig. 4c). También observamos incrementos considerablemente mayores en concentraciones fecales de lactato y una tendencia hacia un incremento mayor en concentraciones fecales de ácido succínico en el grupo de metformina, en comparación con el grupo de placebos, después de 4 meses de tratamiento (Fig. 4d). Se sabe también que la microbiota intestinal es un regulador importantísimo del metabolismo del ácido biliar28, el cual podría contribuir con sus efectos en el metabolismo del huésped. Por otra parte, algunos estudios han indicado un rol potencial de la metformina en la alteración del perfil del ácido biliar29, 30, pero esta relación no ha sido bien establecida. Aquí, investigamos el efecto del tratamiento con metformina durante 4 meses en la composición del ácido biliar fecal y plasmático. No fueron detectados cambios sustanciales en los ácidos biliares fecales después del tratamiento con metformina (Fig. Suplementaria 4a). Sin embargo, observamos incrementos considerablemente mayores en las concentraciones de ácido biliar plasmático (total, primario, secundario, y no conjugado) en el grupo de metformina, en comparación con el grupo de placebos, después de 4 meses de tratamiento (Fig. 4e). Utilizando un análisis meta genómico específico, demostramos una mayor abundancia de hidrolasa de sales biliares, genes que codifican las hidrolasas de sales biliares, después de 2 meses con metformina (Fig. Suplementaria 4b). Estas enzimas son producidas por la microbiota intestinal y catalizan la desconjugación de ácidos biliares conjugados a glicina o taurina, y de esta forma, los incrementos de hidrolasas de sales biliares podrían contribuir con concentraciones mayores de ácidos biliares no conjugados.
Por otra parte, hallamos una correlación negativa considerable entre las concentraciones de ácidos biliares no conjugados y el %HbA1c (rho = −0.27, P < 0.05), lo cual sugiere un posible vínculo entre la modulación de la composición del ácido biliar y el efecto terapéutico de la metformina.
Figure 4 Metformin treatment promotes functional shifts in the gut microbiota. (a) Principal coordinate analysis (PCoA) of all KOs that are significantly
altered from baseline (P0 and M0) after 2 and 4 months in individuals with T2D randomized to placebo (P2 and P4; n = 18) or metformin (M2 and
M4; n = 22). Adonis test based on 5,000 permutations; P
M0 vs. M2
= 0.00040; P
M0 vs. M4
= 0.0062. Data are shown as means ± s.e.m. (b) Pathway-
enrichment analysis of all significantly altered KOs. Hypergeometric test; *FDR < 0.05;
+
FDR < 0.01;
#
FDR < 0.001. (c–e) Boxplots (with median)
showing changes from baseline (P0 and M0) for fecal concentrations of SCFAs (c), fecal concentrations of lactate and succinate (d), and plasma
concentrations of bile acids (e) after 4 months in individuals with T2D randomized to placebo (P4; n = 18) or metformin (M4; n = 22). Wilcoxon
rank–sum test; *P < 0.05; **P < 0.01.
Figura 4 El tratamiento con metformina fomenta cambios funcionales en la microbiota intestinal. (a) Análisis de coordenadas principales (PCoA) de todos los KOs que son alterados considerablemente desde el punto de partida (P0 y M0) después de 2 y 4 meses en individuos con DT2 aleatorizados con placebos (P2 y P4; n = 18) o metformina (M2 y M4; n = 22). Prueba Adonis basada en 5,000 permutaciones; PM0 vs. M2 = 0.00040; PM0 vs. M4 = 0.0062. Los datos se muestran como medias ± e.e.m. (b) Análisis de enriquecimiento de rutas de todos los KOs alterados considerablemente. Prueba hipergeométrica; *FDR < 0.05; +FDR < 0.01; #FDR < 0.001. (c–e) Diagramas de cajas (con media) que muestran cambios a partir del punto de inicio (P0 y M0) para las concentraciones fecales de SCFAs (c), concentraciones fecales de lactato y ácido succínico (d), concentraciones plasmáticas de ácidos biliares (e) después de 4 meses en individuos con DT2 aleatorizados con placebos (P4; n = 18) o metformina (M4; n = 22). Prueba de la suma de rangos de Wilcoxon; *P < 0.05; **P < 0.01.
Efectos directos de la metformina en la microbiota intestinal
Para investigar directamente la forma en que la metformina afecta la microbiota intestinal, realizamos cultivos de muestras fecales (obtenidas antes del tratamiento con metformina, de dos participantes, donantes 13 y 49) en dos experimentos independientes en simuladores del sistema intestinal, y expusimos las muestras a un flujo constante de metformina (10 mM) durante una semana. Posteriormente, realizamos un perfil de los microbiomas mediante secuenciación amplia del genoma completo a nivel tanto de ADN como de ARN. La realización del perfil composicional reveló que la exposición a la metformina alteraba considerablemente la abundancia de ADN y ARN de 24 cepas bacterianas al cultivar las heces del donante 13, pero sólo de 4 para las heces del donante 49 (Tabla Suplementaria 5; FDR < 0.05). Los efectos específicos en los donantes de la exposición a la metformina incluían, por ejemplo, mayor abundancia de ARN de Bilophila wadsworthia (donante 13) y mayor abundancia de ADN de Lachnospiraceae bacterium (donante 49) (Fig. 5a y Tabla Suplementaria 5). La A. muciniphila fue el único taxón que se incrementó en abundancia tanto de ADN como ARN en respuesta a la metformina en ambas muestras, y también fue el taxón que se incrementó más en abundancia (Fig. 5a y Tabla Suplementaria 5). La determinación del perfil funcional de la combinación del metagenoma y el metatranscriptoma mostró que la exposición a la metformina alteraba de forma considerable la abundancia de 686 y 909 KOs en muestras de los donadores 13 y 49, respectivamente (Tabla Suplementaria 6; prueba de Wald, FDR < 0.05). En total, 31 y 38 rutas fueron enriquecidas después de la exposición a la metformina en muestras de los donantes 13 y 49, respectivamente; de estas, 22 rutas enriquecidas eran comunes a ambas muestras (Fig. 5b y Tabla Suplementaria 6; prueba hipergeométrica; FDR < 0.05).
Seis rutas que fueron enriquecidas en las muestras tratadas con metformina en el análisis in vivo del metagenoma (ver Fig. 4b)–incluyendo las de los genes involucrados en la síntesis de LPS, el metabolismo de butirato y ácido pirúvico, y sistemas de dos componentes–también mostraron enriquecerse por la metformina en ambos experimentos de los simuladores del sistema intestinal (Fig. 5b). Además, el análisis in vitro reveló enriquecimiento de rutas metabólicas vinculadas al metabolismo de cofactores y vitaminas (Fig. 5b). Estos resultados demuestran que aunque la metformina ejerce efectos taxonómicos específicos a los donantes, esta induce cambios funcionales microbianos que se sobreponen, en muestras de ambos donadores.
Figura 5 Las interacciones directas metformina-microbiota identificadas utilizando un simulador intestinal in vitro. (a) Determinación del perfil composicional microbiano de muestras tomadas del simulador intestinal in vitro antes (D0) y después de 1 día y de 7 días (D1 y D7) de exposición a la metformina (+MET). Se utilizó materia fecal de dos participantes (donantes 13 y 49) para inocular el simulador intestinal en dos experimentos independientes (es decir, la materia fecal de las dos muestras no fue mezclada). Se muestran las diez principales cepas bacterianas detectadas en las muestras en cada punto del tiempo. (b) Las rutas enriquecidas por la metformina identificadas tanto por análisis metagenómicos como metatranscriptómicos de muestras tomadas del simulador intestinal in vitro. Prueba hipergeométrica; FDR < 0.05. Sólo se muestran las 22 rutas afectadas por la exposición a la metformina en ambos experimentos (recuadro). (c) Diagrama de cuerdas de la ruta KEGG y anotaciones de función molecular para genes regulados por la metformina en la A. muciniphila. El gráfico de barras circulares en el lado izquierdo indica los genes regulados por la metformina dentro del genoma. Rojo, expresión génica considerablemente mayo; azul, considerablemente menor; gris, sin diferencias estadísticas; prueba de Wald; FDR < 0.1. Se destacan los genes regulados por la metformina involucrados en las dos rutas mostradas en (b) (enlaces grises) y codificación de proteínas con capacidades de unión a metales (enlaces rosas). (d) El enriquecimiento de la ontología de los genes (GO) de todos los genes regulados por la metformina en la A. muciniphila; términos GO con relaciones jerárquicas directas padre-hijo, se muestran vinculadas con flechas. Prueba hipergeométrica; FDR < 0.05
Finalmente, realizamos análisis exhaustivos del transcriptoma (utilizando la muestra fecal cultivada in vitro del donante 13) para investigar las interacciones directas entre la metformina y las especies bacterianas individuales. Primero, examinamos las lecturas de ARN que se referenciaron al catálogo de genes de la A. muciniphila (el taxón con la mayor abundancia general en esta muestra fecal; Fig. 5a). Hallamos que casi 10% (207/2138) de los genes codificantes de proteínas en la A. muciniphila eran regulados de forma significativa por la metformina; de estos, 65% eran regulados por la metformina (Tabla suplementaria 7; FDR < 0.1). Por otra parte, 78 de los 207 genes regulados por la metformina pudieron ser anotados a los KOs, y de estos, 41 genes referenciados a las 22 rutas enriquecidas por metformina comunes a muestras fecales cultivadas de ambos donantes (Fig. 5 y Tabla Suplementaria 7). Mediante anotación manual, hallamos que los productos proteínicos de 108/207 genes regulados por la metformina requirieron cofactores o coenzimas como ATP, FAD, FMN, metal, NAD, y vitamina B6 (Fig. 5c y Tabla Suplementaria 7); la mayoría de los genes restantes (63/99) no han sido caracterizados (Tabla Suplementaria 7).
Resulta de particular interés que 81 de los 108 genes anotados regulados por la metformina codificaban metaloproteínas o transportadores metálicos (Fig. 5c y Tabla Suplementaria 7). El análisis de la ontología de los genes (GO) regulados por la metformina en la A. muciniphila confirmó que sus productos génicos estaban enriquecidos con proteínas que se unen a iones metálicos, además de varios otros cofactores y coenzimas, así como a la transferasa, hidrolasa, ligasa, y componentes proteínicos de los ribosomas (Fig. 5d). Para determinar si esas observaciones eran específicas para la A. muciniphila, también analizamos la B. wadsworthia (el segundo taxón más abundante en esta muestra fecal cultivada después del tratamiento con metformina; Fig. 5a). De acuerdo con la detección de homología proteínica, sólo 14 genes regulados por la metformina fueron ortólogos entre estas dos bacterias; sin embargo, la mayoría de los genes anotados regulados por la metformina en la B. wadsworthia también codificaban metaloproteínas (Tabla suplementaria 7).
Fecha: publicado en línea 22 de mayo de 2017
Autores: Hao Wu, Eduardo Esteve, Valentina Tremaroli, Muhammad Tanweer Khan, Robert Caesar, Louise Mannerås-Holm, Marcus Ståhlman, Lisa M Olsson, Matteo Serino, Mercè Planas-Fèlix, Gemma Xifra, Josep M Mercader, David Torrents, Rémy Burcelin, Wifredo Ricart, Rosie Perkins, José Manuel Fernàndez-Real & Fredrik Bäckhed
Nota: Instituto Nutrigenómica no se hace responsable de las opiniones expresadas en el presente artículo.
